| 執行方法及步驟 |
- 沙門桿菌專一性單株抗體的純化: 將分泌7F1A與5E6A單株抗體的融合瘤細胞培養於IMDM/胎牛血清(FBS)，於不同時間點收集上清液，以anti-mouse antibody 進行西方墨點分析，找出抗體含量最高的條件；再以此條件進行大量的融合瘤細胞培養，分泌至上清液的抗體以Protein-A-Sepharose管柱進行純化，以SDS-PAGE檢測抗體純度；將抗體濃縮後置於4℃保存。
- 抗體專一性的驗證: 先分別以Western blot、ELISA和免疫螢光法檢測純化的單株抗體對沙門桿菌裂解液、失活菌體以及純化的LPS之辨識情形。再以生物素標定抗體，配合標定streptavidin的磁珠捕捉游離於溶液中的沙門桿菌，以塗盤與電顯觀察捕捉情形。另外，也進行了抗體膠體金的製備，嘗試以7F1A與5E6A開發沙門桿菌的快篩試紙。
- 以SDS-PAGE、ELISA與dot immunoblotting分析存放於不同溫度的抗體的穩定性。
- 製備免疫磁珠:活化COOH修飾的免疫磁珠，將7F1A抗體嫁接在該免疫持珠上。
- 免疫磁珠與細菌的收集效率:使用107 CFU/mL Salmonella與磁珠依照不同比率進行免疫反應，討論最佳比率的收集率
- 結合電化學阻抗分析的微流體晶片製作:在金薄膜電極晶片上製作出10 mm的微孔，以微製程加工出寬1 mm高100 mm微通道，採用上下相對方式將上電極對準於含有微孔的金薄膜電極上，利於介電泳的操作。
- 真實菌液檢測:使用免疫磁珠收集Salmonella後，該複合體流入微流體晶片，利用介電泳力將Salmonella收集於微孔中，再藉由電化學阻抗法評估訊號與Salmonella濃度之間的關係。
|
| 執行績效 |
- 目前雖有市售的免添加血清的融合瘤細胞培養液，由於不同的細胞營養需求不同，實驗室通常將融合瘤細胞培養在含有10%的FBS，本計畫篩選出抗體表現量不變但對FBS需求量低的7F1A與5E6A的融合瘤細胞，可有效降低大量生產此二單株抗體的成本。
- 7F1A與5E6A的原始抗原為豬霍亂沙門桿菌(Salmonella enterica serotype. Choleraesuis, SC)，前期研究已知此二抗體除了能辨識不同的SC分離株，也對所檢測的鼠傷寒桿菌(Salmonella enterica serotype. Typhimurium, STm)與腸炎沙門桿菌(S. Enteritidis, SE)有顯著的結合力，但不會和其他的腸桿菌科如大腸桿菌與克雷氏菌結合。本研究進一步發現7F1A與5E6A也能辨識其他的沙門桿菌血清型，包含Salmonella Minnesota以及只造成人類感染的霍亂桿菌(S. Typhi)。
- 經標定修飾的抗體穩定性較未標定的抗體差。
- 抗體與磁珠的重量為1:1時可達到固定於磁珠表面的飽和量。
- 免疫磁珠與Salmonella的數量為500:1時具有較佳的Salmonella收集率。
- 該微流體晶片可成功利用介電泳方式收集免疫磁珠-Salmonella複合體於微孔中，且利用阻抗法量化菌液濃度低達102 CFU/mL，如圖1所示，且該晶片經清洗後(rewash)可重複量測。
|
| 結論與建議 |
沙門氏桿菌屬於腸道細菌科，為兼性厭氧的格蘭氏陰性菌。根據DNA的相似度可分為兩個種，分別為S. enterica 與S. bongori；前者包含六個亞種(supspecies)；而根據鞭毛組成蛋白質FimH (H抗原)、表面多醣抗原(Vi) 以及外膜組成lipopolysaccharide上的O antigen結構(O抗原)，Salmonella至少有2600種血清型(serotype or serovar)。由於 H與O抗原變異性大，個別單株抗體能夠辨識的範圍有限，導致檢測鑑別過程中需同時使用約20種抗體；而且日後H與O抗原的持續變異，也有逃避偵測的風險；因此辨識沙門氏桿菌體表面共通抗原的7F1A與5E6A單株抗體，是能達成快速檢驗食品是否受污染或引起感染的關鍵工具，本計畫獲得的低血清需求融合瘤細胞可降低抗體的生產成本，另外也可以利用此二抗體為基礎開發廣效型或血清型專一的快篩試紙。
計畫中已成功使用7F1A抗體製備免疫磁珠與Salmonella收集，在結合介電泳濃縮與電化學阻抗量測的微流體晶片平台中，使用阻抗訊號可對菌液濃度進行量化，且被濃縮在微孔中的複合體可利用重力與流利移除進行再次檢測。該晶片平台可免除抗體修飾程序，僅使用免疫磁珠達到專一性收集，並藉由介電泳將磁珠細菌複合體濃縮到微孔結構內使之遮蔽微孔內電極表面，該方式可大幅提升電化學法的檢測極限，應用免疫磁珠法可大幅縮短各式細菌的免疫反應時間，無須固定抗體的電極更利於大量化製作，該整合電化學感測器之微流體晶片可快速應用於食品病原菌的檢測。
未來該方法將應用於肉品與蛋品安全溯源的利器，可快速應用於禽類或是肉品細菌汙染的監控。 |
| 附件 |
|
